II СЪЕЗД МИКОЛОГОВ РОССИИ
ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ
Раздел 21
Лекарства из грибов
Противоопухолевые свойства макро — и микромицетов Средней Сибири
Громовых Т. И., Ковалева Г. К., Садыкова В. С., Гаврилова А. Г. Сибирский государственный технологический университет, КрасноярскОдним из приоритетных направлений развития современной биотехнологии является изучение возможности использования грибов в качестве продуцентов биологически активных веществ, в том числе обладающих лекарственными свойствами, и разработка на их основе экологически чистых безотходных технологий. Благодаря исследованиям последних десятилетий, стало известно, что грибы являются продуцентами целого ряда биологически активных веществ: белков, липидов, полисахаридов, органических кислот, ферментов, витаминов и др. Многие из этих соединений являются фармакологически активными и, по сравнению с продуктами химического синтеза, менее токсичны и более эффективны при применении в медицинской практике. Важным преимуществом получения биомассы мицелия с помощью биотехнологических методов являются: экологическая чистота получаемых препаратов, неограниченная возможность производства, недефицитность сырьевых ресурсов и безотходность производства.
С целью выявления возможности практического использования как продуцентов веществ, обладающих противоопухолевыми свойствами, было проведено сравнительное исследование микромицетов и макромицетов из коллекции культур Центра биотехнологии и микологии СибГТУ. Работу проводили с сибирскими штаммами базидиомицетов G. a.–04 вида Ganoderma applanatum (Pers. ex Wallr.) Pat и Tyv-2006 вида Fomitopsis officinalis (Will.) Bond. et Sing, выделенными в чистую культуру мицелия из плодовых тел, собранных в лесных комплексах на территории Красноярского края, а также штаммами вида Trichoderma asperellum «МГ-97», выделенного в 1997 г. из почв Маганского лесопитомника и «МГ-6» – моноспоровый клон «МГ-97», выделенный в 2002 г.
Изучение противоопухолевой активности водных экстрактов и метаболитов микромицектов в отношении опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха проводили в экспериментах in vivo на белых мышах аутбредной линии ICR в возрасте 3 месяцев. Контролем в эксперименте служили мыши привитые опухолью с титром клеток 1,65х106 и группа мышей, которым вводили противоопухолевый химический препарат Циклофосфан из расчета 50 мг/кг веса. Водные экстракты, метаболиты и Циклофосфан вводили внутрибрюшинно в объеме 200 мкл каждые 3-е сутки после перевивки опухоли (всего 4 раза).
Противоопухолевый эффект был отмечен во всех группах, по сравнению с контрольной группой мышей. Введение метаболитов и экстрактов грибов не отразилось на общем состоянии мышей, потреблении корма и воды, их поведении, что свидетельствует о хорошей переносимости препаратов. Однако объем опухоли и титр живых клеток при введение экстракта Ganoderma applanatum и Trichoderma asperellum «МГ-97» достоверно не отличался от такового в контрольной группе мышей.
Наибольший противоопухолевый эффект был отмечен в группе животных, которым вводили экстракты плодового тела и мицелия лиственничной губки Fomitopsis officinalis. У 60% животных опухоль не развивалась даже через 20 суток после перевивки, в то время как в группе мышей, которым вводили химический препарат Циклофосфан, торможение роста опухоли было отмечено только 45% контрольных животных. Объем опухоли был в три Раза ниже, чем в группе мышей Циклофосфан и в 5 раз ниже, чем в контрольной группе.
Таким образом, можно утверждать, что в экспериментах in vivo исследуемые водные экстракты и метаболиты проявляют противоопухолевый эффект в отношении опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха. Полученные данные о противоопухолевом действии базидиомицетов и микромицетов рода Trichoderma открывают новые возможности и перспективы использования активных веществ, получаемых из грибов в комплексной терапии рака.
ВЫСШИЕ БАЗИДИАЛЬНЫЕ ГРИБЫ – ПРОДУЦЕНТЫ АНТИВИРУСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Разумов И. А., Казачинская Е. И., Пучкова Л. И., Козлова Н. С., Винокурова А. В., Горбунова И. А., Михайловская И. Н., Локтев В. Б., Теплякова Т. В.Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, п.К ольцово, Новосибирская область
Высшие грибы-базидиомицеты, кроме традиционного пищевого назначения, находят новое использование как продуценты лекарственных и профилактических соединений, обладающих иммуномодулирующим, противоопухолевым, антиаллергенным, антивирусным и другими свойствами.
Учитывая актуальность поиска продуцентов и создания антивирусных препаратов, нами проведено тестирование противовирусной активности 60 различных образцов, приготовленных из штаммов базидиальных грибов, имеющихся в коллекции лаборатории грибных культур Центра.
С этой целью были получены водные экстракты мицелия и плодовых тел базидиальных грибов и выделены полисахаридные фракции. Антивирусная активность экстрактов и фракций изучалась путем оценки инактивации суспензий вируса Западного Нила (ВЗН) и вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2).
В результате было обнаружено, что пробы, полученные из грибов некоторых штаммов, относящихся к видам Ganoderma lucidum, Lentinus edodes, Inonotus obliquus, роду Pleurotus, полностью ингибировали инфекционную активность не менее 100 ТЦД50/0,1мл (50% ткане-цитопатических доз) ВЗН и 100 БОЕ/0,1 мл (бляшкообразующих единиц) ВПГ-2 в культуре клеток Vero.
Наибольшей антивирусной активностью обладали экстракты, полученные из грибных культур, выращенных в жидких питательных средах в стационарном состоянии. Установлено, что антивирусная активность проб из грибов связана с наличием полисахаридов и возрастает по мере их концентрирования. Так, в грибных препаратах, прошедших специальную механическую обработку, где содержание полисахаридов в 10–100 раз выше, чем в препаратах, полученных обычным путем (в результате разрушения биомассы ультразвуком или методом растирания в ступке) антивирусная активность возрастала по мере увеличения их концентрации. Именно эти препараты вызывали не только вирулицидный или нейтрализующий эффект при обработке вирусов, но и лечебный эффект при введении в культуру клеток после инфицирования вирусом.
ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ МЕЛАНИН-ГЛЮКАНОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ТРУТОВЫХ ГРИБОВ
Сенюк О. Ф.1, Горовой Л. Ф.2, Паламар Л. А.1, Ковалев В. А.1, Круль Н. И.1, Рытик П. Г.3, Кучеров И. И.3 1 Институт проблем безопасности АЭС НАН Украины, Чернобыль 2 Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев 3 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии, МинскГрибные меланины, благодаря стабильному свободнорадикальному состоянию и способности обратимо окисляться и восстанавливаться, обеспечивают защиту организма от экстремальных условий, ассоциированных с опухолевой болезнью, при развитии которой в живой клетке генерируются активные свободные радикалы, нарушающие процессы нормальной жизнедеятельности. Механизм действия большинства грибных глюканов основан на мобилизации защитных сил организма. Это определило их широкое использование в восточной медицине для лечения инфекционных, грибковых, нервных, онкологических и целого ряда других заболеваний.
В работе исследовали способность водорастворимого меланин-глюканового комплекса из трутовых грибов (МГК) защищать ядерную ДНК от ультрафиолетового облучения in vitro (50 Дж за 15 мин) и проявлять противоопухолевое действие на in vivo модели спонтанного канцерогенеза у мышей линии ICR. Для изучения генопротекторной активности использовали культуры перевиваемых опухолевых линий (Hela, PC-12), краткосрочные суспензионные культуры человеческих лимфоцитов периферической крови.
Показали, что генопротекторными свойствами обладают МГК, полученные из разных источников – из грибов Inonotus obliquus, Fomes fomentarius, Ganoderma applanatum и комплексного препарата Микотон, созданного на основе биополимеров F. fomentarius.
Наиболее перспективным для создания лекарственных средств является МГК из Микотона ввиду его высокой эффективности, доступности и больших запасов сырья, а также наличия промышленной технологии получения.
В in vitro модели выявили способность этого МГК защищать нормальные клетки от токсического воздействия опухолевых клеток при воспроизведении «эффекта свидетеля» через культуральную среды и при отстутствии общей культуральной среды.
В in vivo модели спонтанного канцерогенеза у мышей линии ICR выявили, что в группе мышей (83 особи), получавших МГК с питьем (1,5 г/л) на протяжении жизни, количество спонтанно возникших опухолей было 1,6 раза меньше, чем в контрольной группе (84 особи). При этом возникновение макроскопических признаков опухолевого процесса в группе, получавшей МГК, в среднем составило 332 + 21 день, в то время как в контрольной группе этот показатель был на 61 день лучше, и средняя продолжительность мышей с опухолевой болезнью в этой группе была на 40 дней больше.
Полученные данные свидетельствуют о наличии у меланин-глюканового комплекса, получаемого из трутовых грибов, высокой протекторной активности по отношению к ядерной ДНК различных нормальных клеток, и наоборот токсической активности в отношении ядерной ДНК злокачественно трансформированных клеток, что подтверждается способностью эффективно противодействовать механизмам спонтанного канцерогенеза у линейных мышей ICR.
АНТИКОАГУЛЯНТНЫЕ СВОЙСТВА ГРИБНЫХ ПРОТЕИНАЗ
Серебрякова Т. Н., Шаркова Т. С., Максимова Р. А., Цыманович С. Т., Подорольская Л. В. Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, МоскваЛаборатории антибиотиков и ферментативного фибринолиза на биологическом факультете МГУ длительное время занимаются исследованием фибринолитически активных веществ, получаемых из культуральных жидкостей непатогенных сапрофитных грибов. In vitro и in vivo изучали действия ферментного препарата трихолизина, полученного из культуральной жидкости сапрофитного гриба Trichothecium roseum, и лонголитина, выделенного из сапрофитного гриба Arthrobotrys longa. Как трихолизин, так и лонголитин при добавлении их к плазме крыс in vitro или при внутривенном введении экспериментальным животным повышали фибринолитическую, активаторную эстеразную и казеинолетическую активности. При введении этих препаратов животным с экспериментально образованными тромбами отмечали полный или частичный лизис этих тромбов. Эти тромболитические свойства препаратов дают основания для надежды использовать их в клинической практике в качестве тромболитических средств. Тромболитические средства, как правило, вызывают активацию системы свертывания крови. Это грозит ретромбозами. Поэтому, интересно более детально изучить антикоагулянтные возможности трихолизина и лонголитина. Изучение проводили in vitro и in vivo. In vitro к плазме крыс добавляли дозы трихолизина и лонголитина, вызывающие лизис экспериментально образованных тромбов (130 мкг/мл плазмы трихолизина и 82 мкг/мл плазмы лонголитина).
Данные тромбоэластограмм после добавления трихолизина и лонголитина свидетельствовали о влиянии этих ферментов как прямых антикоагулянтов. Индекс коагуляции (ci) у контрольных проб (плазма + физиологический раствор) равнялся в среднем значению 2,2 – in vivo и 2,56 – in vitro. Значение ci в опытах с добавлением трихолизина было равно 1,2, а с добавлением лонголитина – 1,4 (в среднем 1,33). Низкий ci соответствует низкой свертываемости плазмы. Таким образом, in vitro ci снижается по сравнению с контролем в 1,9 раза, что свидетельствует о снижении свертываемости плазмы. Показатели тромбоэластограмм «r», «k», «r+k» увеличивались по сравнению с контролем в среднем 1,6 раза. Снижается ma – показатель концентрации фибриногена, т.е. все показатели свидетельствуют, что при добавлении к плазме трихолизина или лонголитина антикоагулянтный уровень плазмы увеличивается. При внутривенном введении трихолизина или лонголитина в тробоэластограммах с записью свертывания плазмы наблюдали достоверное увеличение показателей I фазы свертывания крови – величин r, k, r+k. Максимальная амплитуда (ma) уменьшалась на 17 мм. Индекс коагуляции имел тенденцию к снижению (с 2,2 до 1,4). Полученные данные показывают, что in vitro и in vivo, как трихолизин, так лонголитин не способствуют тромбиногенезу, а уменьшают свертываемость крови, что может быть вызвано значительным повышением фибринолитической активности (с 29 до 54%), удлинением (незначительным) тромбинового времени и уменьшением концентрации фибриногена. Кроме того было показано, что оба фермента образуют с гепарином комплексные соединения, которые обладают неферментативным действием, увеличивая антикоагулянтный уровень крови. На основе полученных данных можно сделать вывод об антикоагулятном действии полученных ферментов и о возможности применения этих препаратов в клинической практике при тромболитической терапии.
ОЦЕНКА БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТОВ АНТИБИОТИКОВ
Тихонова О. В., Ефременкова О. В., Катруха Г. С. Институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской Академии медицинских наук, МоскваЗа прошедшие после открытия пенициллина 80 лет постоянно возрастает число описанных биологически активных соединений различного назначения, образуемых грибами. На протяжении первых тридцати лет при изыскании биологически активных соединений природного происхождения грибы составляли примерно половину общего числа исследуемых организмов разных таксономических групп, однако с 1956 по 1995 г.г. интерес несколько снизился, и грибы составляли лишь четверть исследуемых видов в поисковых исследованиях такого рода. Отмеченное снижение интереса к грибам как к продуцентам можно объяснить тем, что основной поиск новых соединений, в первую очередь антибиотиков, проводился среди актиномицетов, которые в настоящее время представляют группу организмов, уже хорошо изученных в качестве продуцентов биологически активных соединений. В последнее десятилетие опять возрос интерес к грибным продуцентам, в частности к высшим грибам, что отчасти объясняется достижениями биотехнологии в области их культивирования.
В настоящее время известно более 3000 соединений, образуемых грибами. Среди них соединения, обладающие антибиотическим, в том числе противоопухолевым, иммуномодулирующим, гиполиподемическим, гепатопротекторным, противодиабетическим, гипотензивным, цитотоксическим, инсектицидным, антигельминтным, противотромбозным и сосудоукрепляющим действием.
Целью представляемого доклада является оценка базидиальных грибов в качестве продуцентов антибиотиков, т.е. веществ природного происхождения, вызывающих гибель, торможение развития или роста бактерий, грибов, вирусов, простейших, а также опухолевых клеток. Приводится анализ тех публикаций, в которых не возникает сомнений, что новые описанные соединения образуются определенными штаммами базидиомицетов, культивируемыми в условиях чистых культур. Не рассматриваются те публикации, в которых описание новых соединений было проведено с использованием плодовых тел грибов, собранных в природе или выращенных в нестерильных условиях, поскольку источником соединения зачастую оказывались микроорганизмы, присутствовавшие в сырье в виде контаминантов. В ряде публикаций описаны биологически активные соединения различного химического строения, поиск которых проводился на основании воздействия на определенную молекулярную мишень, например, на конкретный фермент, однако во
многих случаях об антибиотическом действии этих соединений не сообщалось.
Придерживаясь принципа химической классификации можно выделить следующие основные группы антибиотиков базидиомицетов: жирные кислоты, ацетилены, ароматические альдегиды и их производные, хиноны и гидрохиноны, производные фурана, нуклеозиды, полисахариды, пептиды, гликолипиды, поликетиды, терпены. Антибиотикам базидиомицетов свойственно большое разнообразие, среди них много непредельных и ароматических соединений, относительно небольшой процент азотсодержащих антибиотиков, преобладают антибиотики терпеноидной структуры.
Важным свойством многих известных антибиотиков базидиомицетов является их высокая избирательность, а также эффективность в отношении штаммов патогенных микроорганизмов, устойчивых к применяемым в медицинской практике антибиотикам. Анализ продуцентов антибиотиков показывает, что для ряда антибиотиков нет строгой приуроченности к определенной таксономической группе базидиомицетов.
Также очевидно, что базидиальные грибы являются перспективными объектами и только начинают исследоваться в качестве продуцентов антибиотиков.
ОЦЕНКА БИОСИНТЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ASPER GILLU S PAR VULU S SMITH
Цыганенко Е. С. Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, КиевНаиболее распространенными в природе микромицетами являются представители родов Аspergillus и Penicillium. Биосинтетические свойства большинства видов хорошо изучены, а многие выделенные и описанные метаболиты, успешно используются в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и других отраслях деятельности человека. Примером могут служить продуценты антибиотиков, токсинов, ферментов, органических кислот, гербицидов, инсектицидов.
Однако, биосинтетические свойства многих видов как Aspergillus, так и Penicillium все еще остаются недостаточно изученными. Наряду с этим, можно предположить возможность поиска новых продуцентов среди штаммов ранее описанных видов, но выделенных из экстремальных или экзотических ниш. Именно к такой группе можно отнести A. parvulus, местом обитания которого является лесная подстилка северной части Украины.
В литературе относительно биосинтетических свойств A. parvulus имеются немногочисленные сведения, которые ограничиваются описанием нескольких метаболитов (аспарвенона, парвуленона и их производных). Однако, данные о биологической активности этих веществ не приводятся.
Ранее нами было показано, что штаммы A. Parvulus, выделенные из различных экологических ниш зоны отчуждения Чернобыльской АЭС, обладают широким спектром биологических активностей, в частности антибиотическими и фитотоксическими. Именно это обстоятельство побудило нас к более обстоятельному
исследованию этих свойств с перспективой возможного практического использования.
Всего было изучено 20 штаммов А. рarvulus, выделенных в 1988 – 2001 гг. из радиоактивной почвы зоны отчуждения Чернобыльской АЭС.
Антибиотическую, фитотоксическую и антифунгальную активности определяли методом лунок, а в качестве тест-организмов использовали: бактерии – грамположительные (Staphylococcus aureus 209,Bacillus subtilis 617, B. licheniformis 5), грамотрицательные (Escherichia coli 2522, Salmonella typhimurium 11), фитопатогенные (Pseudomonas syringae 7591, Erwinia aroideae 8636), дрожжи (Candida albicans 690, C. Kefyr 899, Trichosporon cutaneum 1502) и 16 штаммов зеленых водорослей Chlorella vulgaris и C. kessleri.
Было показано, что в различной степени выраженными антибиотическими свойствами обладали все исследованные штаммы. Так, антибиотическую активность широкого спектра действия проявляли 9 штаммов, которые задерживали рост всех бактериальных тест-культур. Остальные 11 штаммов проявляли антибиотическую активность более узкого спектра действия, среди которых можно выделить 4 штамма, которые задерживали рост только грамотрицательных бактерий и 1 штамм – только фитопатогенных бактерий. В то же время культуральные фильтраты двух штаммов ингибировали рост исключительно S. Typhimurium 11.
По степени проявления фитотоксических свойств штаммы можно разделить на 2 равные группы: либо с высокой, либо с низкой фитотоксической активностью.
Следует отметить, что антифунгальные свойства были характерными лишь для штамма А. Рarvulus 3743 – высокоактивного в отношении C. Albicans 690.
Широкий спектр биологических активностей штаммов А. рarvulus показывает необходимость дальнейшего изучения метаболитов этого микромицета с возможной перспективой практического использования.