Иммуномодулирующие свойства высших базидиальных грибов
М.М. Шамцян, Е.В. Воробейчиков, В.Г. Конусова, А.С. Симбирцев Журнал «Цитокины и воспаление» 2012, № 1В настоящее время известно около 700 видов грибов, проявляющих те или иные виды биологической активности. Наибольший интерес для исследователей представляет иммуностимулирующая активность β-D-глюканов, являющихся компонентами клеточной стенки грибов. Механизм действия этих полисахаридов реализуется через их взаимодействие со специфическими рецепторами на клетках врожденного иммунитета. Стимуляция иммунных реакций определяет лечебные эффекты, вызываемые β-D-глюканами: противоопухолевое, противоинфекционное и антиаллергенное действия. (Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11. № 1. С. 26–32.)
Группа высших базидиальных грибов, названных так из-за наличия особых органов размножения — базидий — наиболее известна человеку и включает около 15 тысяч видов: часть из них съедобны, некоторые ядовиты. Но не только пищевые достоинства этих грибов привлекают людей с древних времен. Восточная медицина до настоящего времени использует их для лечения ряда заболеваний: злокачественных опухолей, гипертонической болезни, диабета, инфекционных болезней, аллергий и т.д. Известно около 700 грибов, обладающих теми или иными лекарственными свойствами [52]. Некоторые виды грибов считаются только медицинскими (Ganoderma lucidum, Phellinus linteus), другие являются пищевыми с лечебным действием (Grifolafrondosa, Agaricus blazei и т. д.). Наибольший интерес ученых во всем мире вызывают иммуностимулирующие и противоопухолевые свойства высших базидиальных грибов. Эти исследования были начаты около 50 лет назад и до настоящего времени ведутся во многих лабораториях не только Азии, где традиционно проявляется интерес к этой проблеме, но и в Европе и Америке.
Иммуностимулирующая и противоопухолевая активность высших грибов связана с полисахаридными или протеин-полисахаридными компонентами их клеточной стенки. Эти полисахариды представлены, в основном, высокомолекулярными β-D-глюканами — полимерами D-глюкозы, широко распространенными в природе и встречающимися не только в грибах, но и в дрожжах, водорослях, лишайниках, злаковых (овес и ячмень), а также в некоторых видах микробов [12, 34, 53]. Молекула β-D-глюкана представляет собой длинную цепочку, состоящую из остатков D-глюкозы, связанных в позициях 1 и 3 β-гликозидными связями с боковыми ответвлениями в положении 1,4 или 1,6. Для злаковых и водорослей типичны боковые ответвления, соединенные с основной цепочкой в позиции 1,4, а для грибов — 1,6 [53]. Установлено, что иммуностимулирующие свойства β-D-глюканов определяются несколькими факторами: строением и размером полисахаридной цепочки, наличием и количеством ответвлений от основной цепи, третичной структурой молекулы, ее весом и зарядом, растворимостью и т. д. [4, 6].
Почему β-D-глюканы активируют иммунную систему млекопитающих, становится понятным из работ последних 20 лет, посвященных исследованиям механизмов врожденного иммунитета [1]. C. Janeway (1989) предположил, что система врожденного иммунитета не может быстро идентифицировать каждый антиген, с которым контактирует организм, поэтому распознает только определенные структуры или фрагменты микробных тел, являющиеся типичными для большинства групп микроорганизмов. Эти структуры получили название «патоген-ассоциированные молекулярные образы (pathogen-associated molecular patterns (PAMP)). В свою очередь, на клетках врожденной иммунной системы (макрофагах и нейтрофилах, дендритных клетках (ДК), В-лимфоцитах) имеется универсальная рецепторная система, распознающая РАМР. Эти рецепторы получили название «образ-распознающие рецепторы» (pattern-recognition receptors (PRR)). Экспрессия таких рецепторов генетически детерминирована. Связывание лиганда этими рецепторами приводит к быстрой активации всех эффекторных клеток без предварительной пролиферации, необходимой для реализации реакций адаптивного иммунитета. Поэтому ответ на РАМР осуществляется практически немедленно. β-D-глюканы, присутствующие в клеточных стенках всех представителей многообразного царства грибов, по всем своим характеристикам являются типичными РАМР [37].
Анализ литературы, посвященный изучению влияния β-D-глюканов высших грибов на иммунную систему достаточно сложен. Проблема, прежде всего, связана с отсутствием стандартного препарата β-D-глюкана. Несмотря на общую для всех химическую формулу (1→6); (1→3), β-D-глюканы различаются длиной полисахаридной цепочки, количеством боковых ответвлений, молекулярным весом, зарядом, третичной конфигурацией, растворимостью и т. д. Поэтому не существует двух препаратов β-D-глюкана с одинаковой структурой и биологическими свойствами.
Основным рецептором, распознающим β-D-глюканы грибов, в том числе и пищевых, является дектин-1 (известный также как CLEC7a), который представляет собой сигнальный тип PRR, не связанных с Toll-кластером. Этот рецептор относится к семейству лектино-подобных рецепторов второго типа и состоит из одного экстраклеточного С-домена, трансмембранной области и цитоплазматического хвоста, представляющего собой иммунорецептор с аминокислотной последовательностью, содержащей 2 тирозина, располагающихся дистально и проксимально относительно мембраны клетки (ITAM-подобная последовательность). Дектин-1 экспрессирован на клетках миелоидного ряда: ДК, моноцитах, макрофагах, в меньшей степени на нейтрофилах [46]. В небольшом количестве эти рецепторы определяются также на В-клетках, некоторых субпопуляциях Т-клеток, на эозинофилах и тучных клетках. Показано, что на естественных киллерах (ЕК) рецепторы дектин-1 отсутствуют.
В результате взаимодействия этого рецептора с β-глюканами происходит ряд событий: ускорение созревания ДК, активизация процессов фагоцитоза и эндоцитоза, респираторный взрыв и образование оксида азота, увеличение продукции метаболитов арахидоновой кислоты, синтез различных цитокинов и хемокинов, определяющих формирование воспаления и развитие защитных реакций врожденного противогрибкового иммунитета [9]. Установлено, что многочисленные биологические эффекты, вызываемые β-D-глюканами через рецептор дектин-1, реализуются различными внутриклеточными путями. Например, индукция таких процессов, как респираторный взрыв в макрофагах и синтез цитокинов IL-10 и IL-12 в ДК проходит по классическому NF-κB пути активации с участием Src и Syk киназ и сигнального адапторного белка CARD9 с привлечением Bcl-10 и MALT1 [41]. Возможна также передача сигнала по классическому пути, с привлечением ЕRК и МАРК вместо CARD9 [45].
Для рецептора дектин-1, описаны альтернативные варианты трансляции сигнала с участием syk: через стимулированный кальциурином нуклеарный фактор активации Т-клеток — NFAT [20]. Как было показано недавно, рецептор дектин-1 на человеческих ДК может индуцировать неканонический, syk-независимый путь с привлечением серин-треониновой киназы Raf1 [21]. Kellу E. K. и др. [28], изучая особенности продукции активных форм кислорода (АФК) и IL-10 человеческими макрофагальными клетками, активированными зимозаном, продемонстрировали участие в этих процессах нового кальций-зависимого сигнального пути с участием кальмодулин-зависимой киназы II (CaMKII): дектин-1–Src-Syk–CaMKII–Руk2. Однако рядом исследователей было показано, что одного рецептора дектин-1 недостаточно для реализации некоторых клеточных реакций, например синтеза TNFα макрофагами. Установлено, что оптимальная продукция этого цитокина возможна только при участии TLR 2 (PRR для пептидогликанов грамположительных бактерий) с интеграцией Syk (дектин-1) и TRIF (TLR) путей передачи сигнала внутри клетки [16, 17]. Вместе с тем, ДК способны синтезировать TNFα без костимуляции TLR 2 [41]. При этом сигнал от рецептора дектин-1 напрямую активирует NF-κB через адапторный белок CARD9 [19]. Эти данные свидетельствуют о том, что рецептор дектин-1 может функционировать как самостоятельно, так и кооперируясь с TLR.
Вторым рецептором, через который реализуется иммуностимулирующее действие β-D-глюканов, является комплементарный рецептор 3 (СR3), известный еще как Мас-1, или интегрин CD11b/CD18. Рецептор CR3 представляет собой гетеродимерный, трансмембранный гликопротеин, состоящий из двух нековалентно связанных цепей: CD11b и CD18 [44]. Этот рецептор локализован преимущественно на нейтрофилах, ЕK, в меньшей степени — на моноцитах, В-клетках (CD5 субпопуляция) и Т-клетках (CD8 субпопуляция). На зрелых макрофагах CR3 отсутствуют. Лигандами для этого рецептора являются молекулы адгезии IСАМ-1, фибриноген, и, как показано в настоящее время, β-D-глюканы. Через CR3 осуществляются такие важные функции, как миграция клеток через эндотелий сосудистой стенки к очагу воспаления, фагоцитоз нейтрофилами, кислородный взрыв, дегрануляция, а также цитотоксичность ЕК. Установлено, что этот рецептор имеет два раздельных связывающих сайта [48]. Один, так называемый лектиновый, расположен на С-терминальном конце CD11b цепи (между остатками 400 и 1092), реагирует с неопсонизированными β-D-глюканами, другой локализован в I домене на N-конце CD11b. Этот сайт специфически связывает iC3b фрагмент С3 компонента комплемента.
Еще 2 рецептора — скавенджер-рецептор и лактозилцерамид —реагируют с β-глюканами грибов. «Скавенджер“-рецептор, или рецептор-»мусорщик“ относится к группе эндоцитозных PRR, локализованных на макрофагах и моноцитах. Основной функцией этого рецептора является участие в метаболизме холестерина. Однако установлено, что рецептор-“мусорщик», помимо ацетилированных липопротеинов низкой плотности, связывает различные РАМР: липополисахариды, липотейхоевые кислоты, β-D-глюканы [2]. Исследователи отмечают, что аффинитет β-D-глюканов к рецепторам-“мусорщикам» определяется их структурой и зарядом [42]. Лактозилцерамид (LacCer; CDw17), входящий в состав клеточных мембран различных видов лейкоцитов, также реагирует с грибными полисахаридами [27]. Связывание этого рецептора на нейтрофилах приводит к увеличению интенсивности кислородного взрыва и усилению антимикробной активности [55]. Исследователи отмечают, что лактозилцерамид реагирует с β-D-глюканами только большого молекулярного веса [50].
Таким образом, клетки иммунной системы несут на своей поверхности набор специфических рецепторов для β-D-глюканов грибов. Имеется четкая структурно-функциональная зависимость, определяющая фармакологические свойства β-глюканов пищевых грибов. Максимальный клеточный ответ возможен только при связывании клеткой β-глюкана с большим молекулярным весом (400–2000 кДа) и сложной третичной структурой, т. к. в этом случае в реакцию включается одновременно большое количество рецепторов [36]. Lowe E. и др. [33] продемонстрировали, что один рецептор на моноцитарной клетке взаимодействует с участком β-D-глюкана, состоящим из 7–10 остатков глюкозы. Однако активации клеток в этом случае не наблюдается.
Изучение фармакодинамики и фармакокинетики грибных полисахаридов было проведено в основном на лабораторных животных. Cheung N. K. и др. и Hong F. и др. проследили путь меченых флуоресцеином β-глюканов в организме животных [5, 25]. Как установлено, полисахариды, поступающие с пищей, связываются с рецепторами дектин-1 на гастроинтестинальных макрофагах и транспортируются в ретикулоэндотелиальные ткани и костный мозг. В макрофагах большие молекулы полисахаридов расщепляются под воздействием ферментов до небольших растворимых β-1,3-глюкановых фрагментов. Преимущественно в костном мозге эти фрагменты выделяются макрофагальными клетками наружу, а затем через CR3-рецепторы захватываются гранулоцитами, ЕK, а также моноцитами и ДК. При парентеральном введении, как показал Rice P. J. и др. [43], фармакокинетика β-глюканов зависит от степени разветвленности и веса молекулы полисахарида, а также его растворимости.
Для понимания механизмов действия β-D-глюканов, выделяемых из высших базидиальных грибов, в последние годы активно изучают их влияние на клетки-эффекторы системы врожденного иммунитета: макрофаги, ДК, ЕK, гранулоциты.
Большое количество работ посвящено изучению влияния грибных полисахаридов на макрофагальные клетки. Синтез различных цитокинов, хемокинов, реактивных форм кислорода, оксида азота, простагландинов, различных ферментов, а также экспрессия на клеточной поверхности широкого спектра PRR и антигенов гистосовместимости обеспечивают участие макрофагов во всех этапах как воспалительной, так и иммунной реакции. Показано, что β-D-глюканы, так же, как липополисахариды и пептидогликаны, являются мощными индукторами синтеза как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов: IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8, IL-12, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора GM-CSF, IL-10, IL-18, IL-23 [10, 34, 51, 52]. Wang S. Y. и др. [51] продемонстрировали, что полисахарид из плодовых тел Ganoderma lucidum увеличивал продукцию макрофагальными клетками IL-1β в 5,1 раза, TNFα — в 9,8 раза, а IL-6 — в 29 раз. На перитонеальных клетках мышей было установлено, что β-D-глюканы стимулируют также фагоцитарную реакцию макрофагов, вызывают продукцию АФК и оксида азота [7].
В исследованиях in vivo была подтверждена способность грибных полисахаридов вызывать синтез и продукцию провоспалительных цитокинов независимо от пути введения [7]. Уровень продукции цитокинов макрофагальными клетками определяется несколькими факторами: количеством экспрессированных на клетках рецепторов дектин-1, конформационными особенностями молекулы полисахарида, а также количественным содержанием эндогенного GM-CSF [19, 22, 36].
- Антиретровирусная активность некоторых видов высших базидиальных грибов
- Биологические свойства базидиального макромицета Piptoporus betulinus
|
Рытик П. Г., Горовой Л,ф, Кучеров И. И., Сенюк О. Ф., Мистрюкова Л. О., Белорусский НИИ эпидемиологии и микробиологии, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины Использование высших грибов в медицине имеет длительную традицию. В Азиатских странах их издревле применяли для лечения многих заболеваний. В Западном полушарии пристальный интерес к ним как к потенциальным лечебным средствам стали проявлять лишь в прошлом веке. Известно, что доля полезных грибов среди открытых составляет не более 5%, тогда как изученные и используемые в пищевой и медицинской промышленности встречаются совсем редко. (1). Специалисты, изучавшие вегетацию грибов, допускают, что непременным условием их сохранения как вида является образование и присутствие в строме антибактериальных и антифунгиальных химических структур. Если это так, то нет ничего удивительного в том, что из некоторых видов могут быть изолированы полезные для человека компоненты. Среди зарекомендовавших себя лечебных препаратов широкую известность приобрели лишь те, которые выделены из микроскопических грибов. Достаточно упомянуть в этой связи о пенициллине и др. антибиотиках. В настоящем сообщении мы обратимся только к тем представителям высших грибов, экстракты которых обладали антивирусными свойствами. Так, в обзоре Brandt et al. (2) приводятся многочисленные примеры выявления антивирусного эффекта как у цельных экстрактов, так и отдельных фракций некоторых видов базидиальных грибов. Механизм антивирусного действия отличался разнообразием: отдельных случаях эффект обеспечивался воздействием на продукцию вирусных ферментов, а в других — на синтез нуклеиновых кислот вирионов или на фазу адсорбции их рецепторами клетки-хозяина. Крупные молекулы (полисахариды и др. комплексы) воздействовали опосредованно, стимулируя реакции иммунитета. Motana et al. (3) сообщают, что экстрагированные из Ganoderma pfeifferi тритерпены, в частности, ганодермадиол, люцидадиол, аппланоксидевая кислота G ингибировалиin vitro вирус гриппа А. Первое из упомянутых соединений было также активно и в отношении вируса простого герпеса 1-го типа. Другие исследователи (El-Mekkawy et al.), изучая экстракты из Ganoderma lucidum (Рейши), обнаружили выраженную активность, направленную на ВИЧ-1. Так, даже чрезвычайно малая доза ганодериола F и ганодерманонтриола (7,8 мг/мл) полностью прекращали репликацию ВИЧ, выращиваемого на клеточной линии МТ-4. Сходный эффект отмечали Ichimura et al.: воднорастворимые лигнины из Inonotus obliquus ингибировали протеазу ВИЧ-1 (5). Tochikura et al. (6,7) и Suzuki et al. (8) регистрировали выраженную анти-ВИЧ-активность питательной среды, используемой для выращивания мицелия Lentinus idodes (Шиитаке). Механизм ингибиции авторами не изучался. Colins (9) и Wang (10) пошли дальше. Первый из них, изучавший Coriolus versicolor, доказал, что получаемые им полисахаридно-белковые комплекс активно препятствовали адсорбции ВИЧ CD4 (+)- лимфоцитами. Второй, на примере выделенного из Flammulina velutipes низкомолекулярного белкового комплекса, привел убедительное подтверждение тому, что экстракт грибов могут нейтрализовать вирусную обратную транскриптазу. Все приведенные выше факты явились для нас побудительным мотивом для поиска противовирусных средств из местных высших базидиальных грибов. Испытаниям подверглись 7 природных меланин-глюкановых комплексов, полученных экстракцией из высших грибов вида Inonotus obliquus (препараты № № 357, 358 и МГК-7), Lentinus edodes (МГК-8), Ganoderma applanatum (МГК-9), Phellinus igniarius (МГК-10) и Fomes fomentarius (МГК-11). Для исследований использовались перевиваемые Т-лимфобластоидные линии CEM.SS и МТ-4, инфицированные высокорепликативным штаммом ВИЧ-1. Рабочая доза вируса находилась в пределах 6,0-8,0 IgТЦД50. Ингибирующий эффект оценивался тремя различными тестами: формазановая реакция (ФТ), окраска инфицированной клеточной линии витальным красителем трипановый синий (ОТС) и реакция непрямой иммунофлюоресценции (НИФ). Во всех случаях исследования базировались на результатах так называемой терапевтической схемы контроля (испытуемые препараты вносились в культуральную среду одновременно с вирусом). Итоговые данные испытаний приведены в таблице 1. Таблица 1. Диапазон антиретровирусной активности меланин-глюкановых комплексов из высших базидиальных грибов
Даже беглый анализ приведенных в таблице результатов позволяет убедиться в проявлении препаратами высокой степени противовирусной активности. Особенно это относится к соединениям, полученным из грибов вида Inonotus obliquus. Кумулятивный критерий эффективности препарата — химиотерапевтический индекс — свидетельствует одновременно как о слабой токсичности вещества, так и о его чрезвычайно высокой активности. Существенные расхождения в уровнях ингибирующей вирус активности, проявляемой одним и тем же препаратом (МЭК — минимальная эффективная концентрация соединений № 357 и 358 колебалась в разных опытах от 0,4 до 10,0 мкг/мл) отражают лишь разную степень чувствительности каждого из использованных методических приемов. Среди других проверенных биологически активных соединений выделяются комплексы МГК-7,9,11. По всем критериям, им следует отдать предпочтение при выборе кандидатов потенциальных средств из арсенал химиотерапии ВИЧ-инфекции. Работа выполнена при финансовой поддержке фонда фундаментальных исследований Беларуси (проектБ05К-014).
Литература 1. Lindequist U., Niedermeyer THL., and Juelich WD. The Pharmacological Potential of mushrooms. CAM, 2005? 2 (3): 285-299. 2. Brandt CR., Piraino F Mushroom antivirals. Resent Res. Dev. Antimicrob. Agents Chemother. 2000, 4: 11-26. 3. Motana RAA, Awadh NAA, Jansen R. et al. Antiviral Ianostanoid triterpenes from the fungus Ganoderma Pfeifferi BRES. Fitoterapia 2003; 74: 177-180. 4. El-Mekhawy S., Meselhy MR, Nakamura N. et al. Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease substances from Ganoderma Lucidum. Phytochemistry. 1998; 49: 1651-1657. 5. Ichimura T., Watanabe O., Maruyama S. Inhibition of HIV-1 protease by water-soluble lignin-like substance from an edible mushroom. Fuscoporia obligua. Biosci. Biotechnol Biochem 1998; 575-577. 6. Tochikura TS, Nakashima H, Ohashi Y et al. Inhibiton (in vitro) of replication and of the cytopathic effect of HIV by extract of the culture medium of Lentinus edodes mycelia. Med. Microbiol. Immunil. 1998; 177: 235-244. 7. Tochikura TS, Nakashima H, Hirose K et al. A biological response modifier. PSK, inhibits HIV in vitro. Biochem. Biophys Res. Commun 1987; 148: 726-733. 8. Suzuki H, Okubo A, Yamazaki S et al. Inhibition of the infectivity and cytopathic effect of HIV by water-soluble lignin in an extract of the culture medium of Lentinus edodes mycelia. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989; 160: 367-373. 9. Colins RA., Ng TB. Polyaccharopeptide from Coriolus versicilir has potential for use against HIV-1-infection. Life Sci. 1997; 60: PL 383-387. 10. Wang HX, Ng TB. Isolation and characterization of vecutin, a novel low-molecular-height ribosom-inactivating protein from winter mushrooms (Flammulina velutipes) fruiting bodies. Life Sci. 2001; 68: 2151-2158.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||